Técnicas de Microscopia
     
 

Contraste de fase

Microscopia de contraste de fase, descrita pela primeira vez em 1934 pelo físico holandês Frits Zernike, é uma técnica de contraste de reforço ótico que pode ser utilizada para produzir imagens com alto contraste de espécimes transparentes, tais como células vivas (geralmente na cultura), os microrganismos, as fatias de tecido fino , padrões litográficos, fibras, dispersões de látex, fragmentos de vidro e partículas subcelulares (organelas, incluindo os núcleos e outros).



Com efeito, a técnica de contraste de fase utiliza um mecanismo óptico para traduzir pequenas variações na fase em mudanças correspondentes em amplitude, que pode ser visualizado como diferenças no contraste da imagem. Uma das principais vantagens da microscopia de contraste de fase é que as células vivas podem ser examinados em seu estado natural, sem antes ser morto, fixo, e coradas. Como resultado, a dinâmica do curso os processos biológicos podem ser observadas e gravadas em alto contraste acentuado com clareza de detalhes espécime minuto.

Apresentado na Figura 1 é um diagrama em corte de um moderno microscópio de contraste de fase vertical, incluindo uma ilustração esquemática do trem de contraste de fase óptica. Parcialmente iluminação coerente produzida pela lâmpada de tungstênio-halogênio é direcionado através de uma lente de colecção e focado em um anel especializados (rotulado anel condensador) posicionada na frente do condensador substage plano focal. Frentes de onda que passa pelo anel iluminar o modelo e quer passar desvia ou difratado e retardo na fase de estruturas e gradientes de fase presente na amostra. Desvia e luz difratada coletados pelo objectivo é segregado no plano focal posterior por uma placa de fase e focado no plano de imagem intermediário para formar a imagem final de contraste de fase observada no oculares.

Antes da invenção das técnicas de contraste de fase, iluminação brightfield transmitido foi um dos modos de observação mais comumente utilizados em microscopia óptica, especialmente para fixo, os espécimes manchados ou outros tipos de amostras com alta absorção natural da luz visível. Coletivamente, os espécimes prontamente fotografada com iluminação brightfield são denominadas objetos amplitude (ou exemplares), pois a amplitude ou a intensidade das frentes de onda de iluminação é reduzida quando a luz passa através da amostra.

A adição de contraste de fase acessórios ópticos a um microscópio de campo claro padrão pode ser utilizado como uma técnica para tornar um efeito de contraste de reforço em amostras transparentes, que é uma reminiscência de coloração óptica (ver figura 2). As ondas de luz que são difratados e deslocado em fase de amostra (denominado um objeto de fase) pode ser transformado de contraste de fase em diferenças de amplitude que são observáveis na oculares. Grande, os espécimes estendida também são facilmente visualizadas com óptica de contraste de fase, devido a fenômenos de difração e espalhamento que ocorrem nas bordas dos objetos. O desempenho dos microscópios contraste de fase moderna é tão refinado que permite que amostras contendo pequenas estruturas internas, ou mesmo apenas algumas moléculas de proteína, para ser detectada quando a tecnologia é acoplado ao acessório eletrônico e processamento pós-aquisição da imagem.

Apresentado na Figura 2 é uma comparação de células vivas em cultura imaged em ambos claro e iluminação de contraste de fase. As células da glia são tecido cerebral humano cultivadas em cultura em monocamada banhada com um meio nutriente contendo aminoácidos, vitaminas, sais minerais e soro fetal bovino. Na iluminação brightfield (Figura 2 (a)), as células aparecem semi-transparente com apenas regiões altamente refrativo, como a membrana, núcleo e células acopladas (arredondados ou esféricos), sendo visível. Quando observadas através de contraste de fase acessórios ópticos, o mesmo campo de visão revela detalhes muito mais estrutural (Figura 2 (b)). Cellular acessórios tornam-se perceptíveis, assim como grande parte da estrutura interna. Além disso, o intervalo de contraste é melhorado dramaticamente




Zernike desenvolvimento da teoria óptica de contraste de fase é um excelente exemplo de como os resultados da investigação de um campo altamente especializado (neste caso, a física teórica) pode render empreendimentos inovadores em áreas aparentemente não relacionadas, como biologia e medicina. Durante a Segunda Guerra Mundial, a empresa Zeiss Optical em Jena, na Alemanha, foi o primeiro fabricante a incorporar práticas óptica de contraste de fase em seus microscópios. O impacto imediato na pesquisa biológica foi significativa, ea aplicação generalizada da técnica continua até os dias atuais. objectivos fase moderna contrário, concebida e produzida pela Nikon e outros fabricantes de óptica, são capazes de operar em combinação com técnicas auxiliares para aumento do contraste, como contraste de interferência diferencial, fluorescência e de luz polarizada. Estes objectivos estão disponíveis com placas fase interna que têm diferentes níveis de absorção e deslocamento de fase do surround (undiffracted) de iluminação para produzir uma ampla gama de modelos e opções de contraste de intensidade de fundo para microscopia de contraste de fase.

Interação da luz com os espécimes Waves Fase

Uma frente de onda incidente presentes em um raio de iluminação de luz torna-se dividido em dois componentes ao passar através de um modelo de fase. O componente principal é um desvia (ou undiffracted; wavefront planar ordem zeroth), comumente referido como o surround (S) da onda, que passa e em torno do modelo, mas não interagir com ele. Além disso, um desvio ou difratado wavefront esférico (D-ondas) também é produzido, que se dispersa ao longo de um amplo arco (em muitos sentidos) que passa através da abertura total da objetiva. Depois de deixar o avião modelo, surround e difratado ondas de luz entra o elemento frontal da lente objetiva e posteriormente focado no plano de imagem intermediário onde se combinam para produzir através da interferência de uma onda partícula resultante (muitas vezes referida como uma onda P). A relação matemática entre as ondas de luz diferentes gerada em microscopia de contraste de fase pode ser descrita simplesmente como:

P = S + D

Detecção da imagem do modelo depende da diferenças de intensidade relativa, e, portanto, as amplitudes, as partículas e surround (P e S) ondas. Se as ondas de amplitudes da partícula e surround são significativamente diferentes no plano da imagem intermediária, em seguida, a amostra adquire uma quantidade considerável de contraste e pode ser facilmente visualizado nas oculares do microscópio. Caso contrário, o modelo continua a ser transparente e aparece como seria normal em condições de campo claro (na falta de contraste de fase ou de outras técnicas para aumento do contraste).

Em termos de variações de percurso óptico entre o modelo e seu meio circundante, a parte da frente de onda da luz incidente que atravessa a amostra (D-ondas), mas não passa através do meio envolvente (onda S), é um pouco retardado. Para argumentos em microscopia de contraste de fase, o papel do espécime em alterar o comprimento do caminho óptico (na verdade, a mudança de fase relativa) de ondas passando é de suma importância. Na óptica clássica, o comprimento do caminho óptico (OPL) através de um objeto ou espaço é o produto do índice de refração (n) ea espessura (t) do objeto ou da intervenção, como descrito por meio da relação:

Comprimento do caminho óptico (OPL) = t × n

Quando a luz passa de um meio para outro, a velocidade seja alterada proporcionalmente à diferença do índice de refração entre os dois meios. Assim, quando uma onda de luz coerente emitida pelo filamento do microscópio foco passa por uma fase de modelo com uma espessura específica (t) e índice de refração (n), a onda é de um aumento ou diminuição na velocidade. Se o índice de refração da amostra é maior do que o meio circundante, a onda é reduzida a velocidade ao passar pelo modelo e posteriormente é retardado em fase relativa quando se emerge da amostra. Em contraste, quando o índice de refração do meio envolvente superior ao da amostra, a onda está em fase avançada quando sair o modelo. A diferença na localização de uma frente de onda emergente entre o modelo e meio circundante é chamado de deslocamento de fase (δ) e é definido em radianos como:

δ = 2πΔ / λ

Na equação acima, o prazo  é referido como a diferença de percurso óptico, que é semelhante ao comprimento do percurso óptico:

Optical Path Difference (OPD) = Δ = (n2 - n1) × t

onde n (2), o índice de refração da amostra e n (1) é o índice de refração do meio circundante. Os resultados do percurso óptico diferença entre o produto de dois termos: a espessura da amostra, e sua diferença no índice de refração com o meio circundante. Em muitos casos, a diferença de caminho óptico pode ser bastante grande, embora a espessura da amostra é pequeno. Por outro lado, quando o índice de refração da amostra é igual ao do meio circundante, a diferença de caminho óptico é zero, independentemente de a espessura da amostra é grande ou pequeno.

Comprimento do caminho óptico

Explore os efeitos das mudanças de índice de refração ea espessura do comprimento do percurso óptico, e descobrir como duas amostras podem ter diferentes combinações destas variáveis, mas ainda apresentam o comprimento do caminho mesmo.

Para as células individuais em cultura de tecidos, a diferença de percurso óptico é relativamente pequena. Uma célula normal em cultura em monocamada tem uma espessura de cerca de 5 mícrons e um índice de refração de aproximadamente 1,36. A célula está rodeada por um meio de cultura com um índice de refração de 1,335, o que produz uma diferença de percurso óptico de 0.125 micrômetros, ou cerca de um quarto de comprimento de onda (luz verde). estruturas subcelulares gerar retardos muito menor. Estas pequenas diferenças de caminho óptico produzir uma redução linear de intensidade crescente com mudança de fase (a imagem cresce progressivamente mais escuro) até um certo ponto (dependendo da configuração da placa de fase), após o qual a imagem se torna mais brilhante modelo por meio da inversão de contraste. Na microscopia de contraste de fase, a intensidade de uma imagem não tenham uma relação linear simples para a diferença de percurso óptico produzido pela amostra de toda a espessura e intervalo de índice de refração. Em vez disso, a intensidade é dependente de uma variedade de fatores, incluindo a absorção na placa fase, o grau de avanço ou atraso de fase na placa de fase, eo sinal relação dessa mudança de fase.

Interações Wave em microscopia de contraste de fase

Relações de fase entre os cercam, difratadas, e partículas (S, D e P) de ondas na região da amostra no plano de imagem de microscopia de campo claro (na falta de contraste de fase acessórios ópticos) são apresentados na Figura 3. O surround e ondas de partículas, cujo parente amplitudes determinar a quantidade de contraste da amostra, estão ilustradas as linhas vermelha e verde (respectivamente). A onda produzida pela difração da amostra, que nunca é observado diretamente, é descrito como uma onda azul de menor amplitude. O surround e recombinar ondas difratadas através da interferência de gerar a onda de partículas resultantes no plano da imagem do microscópio. A amplitude de cada onda ilustrada na Figura 3 representa a soma dos vetores elétrico das ondas de componente individual.





Relativo à surround onda, a onda difratada tem menor amplitude (porque há menos de surround fótons difratados no ponto da imagem) e está em fase retardada por cerca de 90 graus (um comprimento de onda trimestre) por meio da interação com o modelo. A mudança de fase da onda ligeira 1/20th exibido pela onda partícula resultante (que decorre da interferência entre as ondas e difratado surround) é normalmente observada para detalhes minuciosos em uma célula, e está relacionada com a diferença de caminho óptico. Porque as amplitudes das ondas surround e partículas são quase os mesmos, o modelo completamente transparente falta de contraste e é quase invisível quando sobreposta contra o fundo brilhante.

A relação entre frentes de ondas individuais em claro e microscopia de contraste de fase pode ser descrita vetorialmente usando um sistema de coordenadas polares. Neste sistema, o comprimento do vetor representa a amplitude de uma onda especial, enquanto o ângulo de rotação do vetor em relação a uma referência fixa (o deslocamento de fase angular) representa o grau de deslocamento de fase (ver Figura 3 (b)). Vector representação de interações onda em microscopia de contraste de fase foi introduzida por Frits Zernike, e mais tarde desenvolvida em detalhe por Robert Barer. Apesar desta ajuda descritiva é raramente utilizado hoje em dia, muitos textos e relatórios de pesquisa publicados nos últimos anos, contam com as discussões de relações onda ilustrados por diagramas vetoriais.

Em diagramas de fase vetor contrário, retardos de fase são ilustrados como rotação no sentido horário (com referência a um azimute arbitrário), enquanto os avanços fase são descritos como rotação anti-horário. Na Figura 3 (b), que é tecnicamente um diagrama fasorial, a soma vetorial das surround (S) e difratado (D) de ondas rendimentos da partícula resultante (P) wavefront. Este mecanismo de apresentar as relações de onda é conveniente, pois auxilia a visualização das mudanças de fase da onda difratada e como eles afetam a fase da onda partícula resultante (e vice-versa). A mudança de fase da onda difratado em relação à onda de surround no gráfico da Figura 3 (b) é apresentado como Φ, onde:

Φ = ± 90 ° + φ / 2

Na equação, φ é a mudança de fase relativa (em função da diferença de percurso óptico) entre as surround (S) e partículas (P) vetores de onda. Para os espécimes exibindo uma diferença insignificante caminho óptico (na verdade, nenhuma mudança de fase), o último termo da equação é igual a zero e torna-se Φ ± 90 graus. Conforme apresentado na Figura 3 (b), a difração (D) onda tendo uma amplitude muito baixa e pequena (ou inexistente) os resultados de deslocamento de fase em uma onda de partículas com uma amplitude que é quase igual à da onda surround. Quando o cercam e ondas de partículas têm amplitudes semelhantes (ou intensidades), não há geração de contraste, ea amostra permanece invisível em um fundo brilhante.

O microscópio de contraste de fase

O conceito mais importante para o desenho de um microscópio de contraste de fase é a separação de surround e frentes de onda difratado emerge da amostra, que são projetadas em diferentes localizações no plano focal posterior objectivo (o plano de difração da abertura da objectiva traseira). Além disso, a amplitude do surround (desvia) luz deve ser reduzida ea fase avançada ou retardada (por um comprimento de onda trimestre), a fim de maximizar as diferenças de intensidade entre o modelo e plano de fundo no plano da imagem. O mecanismo de geração de atraso de fase relativa é um processo de duas etapas, com as ondas difratadas em fase retardada por uma onda no trimestre a amostra, enquanto que o cercam as ondas estão avançadas (ou retardado), em fase por uma placa colocada na fase ou muito próximo do plano focal traseira objetivo. Apenas dois acessórios especializados são necessários para converter um microscópio de campo claro para a observação de contraste de fase. Um diafragma anular especialmente concebidos, que é compensada de diâmetro e opticamente conjugado a uma placa de fase interna que residem no plano focal posterior objectivo, é colocado na frente do condensador plano focal.




O anel condensador (ilustrada na Figura 1 e Figura 4) é geralmente construído como uma opaco liso-preto (absorção de luz) com um anel de chapa transparente anelar, que é posicionada no plano focal da frente (abertura) do condensador de modo que o modelo pode ser iluminada por desfocado, paralelamente frentes de onda de luz que emana do anel. O microscópio imagens condensador diafragma anular no infinito, enquanto que o objectivo produz uma imagem no plano focal traseira (onde uma placa conjugada fase está posicionado, como discutido abaixo). Note-se que muitos textos descrevem os emergentes iluminação do condensador de um microscópio de contraste de fase como um cone oco de luz com um centro escuro. Este conceito é útil para descrever a configuração, mas não é estritamente exato. O condensador anel ou substitui ou residir próximo ao diafragma ajustável na abertura frontal do condensador. Ao realizar experimentos contraste de fase utilizando um condensador com tanto um anel de fase e um diafragma de abertura, verifique se o diafragma está mais aberto do que na periferia do anel de fase. Ao contrário de contraste de interferência diferencial e contraste modulação Hoffman, a geometria circular da iluminação de contraste de fase permite a detecção e observação de amostras sem artefatos de orientação para o cargo. O contraste de fase também é insensível à polarização e efeitos de birrefringência, que é uma grande vantagem na análise de células vivas crescendo em vasos de plástico de cultura de tecidos.

Em condições de iluminação Köhler, surround ondas de luz que não interagem com a amostra são focalizados como um anel de brilhante no plano focal posterior da objetiva (o plano de difração). Nestas condições, o plano focal traseira objetivo é conjugado ao plano de abertura de refrigerante da frente, por isso não difratado (ordem zero) as ondas de luz formam uma imagem clara do anel condensador na abertura posterior da objetiva (sobreposto à imagem do fase de placa). A frente de onda esférica que é difratado pela amostra (as ondas D) passa através do plano de difração em vários locais em todo o objetivo da abertura traseira inteira. A distribuição (quantidade e localização) da luz difratada depende do número, tamanho e índice de refração diferencial dos objetos de dispersão da luz na amostra. Para a maioria das amostras, apenas uma pequena parte das ondas de luz incidente é difratada, e que a maioria da luz passa através desvia para finalmente iluminar o plano da imagem inteira.

Em contrapartida, o surround wavefront planar ocupa uma proporção menor da abertura objetivo traseira, o que corresponde ao conjugado do anel condensador. Assim, as duas frentes de onda não se sobrepõem de forma significativa, e ocupam porções diferentes do plano focal traseira objetivo. Porque a direta, a luz de ordem zero e luz difratada são espacialmente separadas no plano de difração, a fase de cada componente de onda (surround, S ou difratado, D) pode ser seletivamente manipulados sem interferir com o outro.

Microscópio óptico Fase Pathways

Examine os caminhos de luz através de um microscópio de contraste de fase e aprender como esses sistemas dissecar o incidente de ondas eletromagnéticas em um surround (S), difratado (D), e partículas resultantes (P) de componente.

A placa de fase é montada dentro ou perto do plano focal posterior objectivo (ver figuras 4 e 5), a fim de seletivamente alterar a fase ea amplitude do surround (ou desvia) luz que passa através da amostra. Em alguns objectivos de contraste de fase, a fase fina placa contém um anel gravado no vidro, que reduziu a espessura, a fim de avançar diferencialmente a fase de surround (S) vaga por quarto de comprimento de onda. Muitas vezes, o anel também é revestido com uma película metálica absorvendo parcialmente para reduzir a amplitude surround luz por 60-90 por cento. Porque o plano focal posterior geralmente reside perto de um elemento de lente interna, alguns objetivos de contraste de fase são produzidas por ataque realmente na superfície de uma lente. Independentemente da forma como o objectivo é fabricado, o ponto mais importante a lembrar é que cada objetivo de contraste de fase é modificado para incluir a placa de fase, uma característica que está ausente de todos os outros objectivos microscópio.

Como a onda partícula resultante é produzido exclusivamente pela interferência do surround e frentes de onda difratado, interferência entre as frentes de onda que chegam ao plano de imagem gera uma partícula (P) onda tendo uma amplitude que é agora consideravelmente menor do que o cercam, quando a densidade neutra revestimento é aplicado. O efeito líquido é transformar a diferença de fase relativa introduzida pelo modelo em uma diferença de amplitude (intensidade) da luz que emerge do plano da imagem. Porque o olho humano interpreta as diferenças na intensidade como contrapartida, o modelo é agora visível na ocular do microscópio, e também pode ser capturada no filme com um sistema de câmeras tradicionais, ou digitalmente, utilizando um dispositivo CCD ou CMOS. Todos os sistemas de contraste positivo fase seletiva avançar a fase do linear surround (S) wavefront relação ao do difratado esférico (D) wavefront. Em alternativa, contraste de fase negativa retarda o surround wavefront com respeito às ondas de luz difratada pela amostra.

Em geral, as amostras com um alto índice de refração que o meio circundante aparecem escuras sobre um fundo cinza neutro, enquanto que os espécimes que apresentam menor índice de refração que o meio de banho parecem mais brilhantes do que o fundo cinza.

Isso nem sempre é o caso, no entanto, porque os objectivos contraste especializada fase ter maior densidade neutra associada a valores menores de retardamento (um oitavo de um comprimento de onda ou menos) pode produzir a inversão de contraste, em amostras mais espessas. O resultado é que as regiões com diferenças muito elevadas caminho óptico começam a aparecer brilhante.

Para modificar a fase e a amplitude do surround espacialmente separados e frentes de onda difratado de contraste de fase em sistemas ópticos, um número de configurações de placa fase foram introduzidas. Como a placa de fase está posicionado dentro ou muito próximo do plano focal traseira objetivo (o plano de difração), toda a luz que passa através do microscópio deve viajar através deste componente. A porção do prato fase em que o anel condensador é focalizado é chamada de área conjugada, enquanto que as regiões restantes são referidos coletivamente como a área complementar. A área conjugada contém o material responsável pela alteração da fase do surround (undiffracted) por uma luz mais ou menos 90 graus em relação ao de frentes de onda difratado. Em geral, a fase de área conjugada placa é maior (cerca de 25 por cento) do que a região definida pela imagem do anel condensador, a fim de minimizar a quantidade de luz que se espalha surround em área complementar.





Uma série típica dos objectivos de contraste de fase em conta a ampliação cada vez maior, e os seus anéis condensador correspondentes, são apresentados na Figura 5. Como regra geral, quando a abertura numérica objetiva e ampliação é maior, a largura da placa de fase e diâmetro diminuir tanto. Em contrapartida, o condensador anel aumenta o tamanho com objetivo de ampliação. Também ilustrada na Figura 5 estão em corte diagramas mostrando os conceitos básicos por trás da construção positivos e negativos fase placa. A placa de fase positiva produz um contraste escuro e contém um filme parcialmente absorvente destinado a reduzir a amplitude do surround wavefront. Além disso, esta placa contém fase de retardamento material destinado a mudança (retard) a fase da luz difratada de 90 graus. A placa de fase negativa também contém retardando fase e parcialmente materiais absorventes. No entanto, neste caso, ambos os materiais são colada na placa fase para que o cercam undiffracted frente de onda é a única espécie afetada (atenuada e retardo na fase de 90 graus).

A maioria das placas fase disponibilizados pelos fabricantes microscópio modernos são produzidos por deposição a vácuo de filmes finos dielétricos e metálicos em uma placa de vidro ou diretamente em uma das superfícies de lente na objetiva do microscópio. O papel do dieléctrico é mudar a fase da luz, enquanto o filme metálico undiffracted atenua a intensidade da luz. Alguns fabricantes utilizam revestimentos anti-reflexo múltiplas em combinação com os filmes finos para reduzir a quantidade de brilho e luz difusa refletida de volta para o sistema óptico. Se a placa de fase não é formado na superfície de uma lente, geralmente é cimentado entre as lentes de sucessivos que residem perto do plano focal traseira objetivo. A espessura e os índices de refração das películas dielétricas, metálico, e anti-reflexiva, bem como as do cimento ótico, são cuidadosamente selecionadas para produzir a mudança de fase necessário entre as áreas complementares e conjugado da placa de fase. Na terminologia óptica, placas fase que alteram a fase de surround luz em relação à luz difratada de 90 graus (positivos ou negativos) são chamados de chapas quarto de comprimento de onda por causa de seus efeitos sobre a diferença de caminho óptico.

O contraste é modulado pela variação das propriedades da placa de fase, incluindo a absorção do filme metálico (ou revestimentos anti-reflexo), o índice de refração da fase de retardamento material, ea espessura da placa de fase. Vários fabricantes de microscópio oferecem uma variedade de objectivos de contraste de fase com graus progressivos de contraste. Por exemplo, a Nikon programação inclui cinco tipos de objectivos de contraste de fase. O DL (Dark Low) série de objectivos produz um contorno da imagem escura sobre um fundo cinza claro. Estes objectivos visam a prestação de contraste positivo em amostras com uma diferença significativa no índice de refração do meio envolvente, como as células de cultura de tecidos. Um dos objectivos versão ligeiramente menor contraste, a DLL (Dark Low Low), os rendimentos melhores imagens na iluminação brightfield do que os objectivos DL, e é utilizado como um objetivo universal para as observações combinadas de fluorescência, brightfield, campo escuro e contraste de interferência diferencial. Nikon também produz um objectivo contrário apodizada fase que contém um anel de densidade neutra secundário, concebido para reduzir os artefatos halo, em ambos os lados do anel central fase. As amostras com diferenças muito pequenas fase são candidatos ideais para a imagem latente com DM Nikon (Medium Dark) Os objectivos fase positiva contraste, que produzem um esboço da imagem escura sobre um fundo cinza médio. Por contraste de fase negativa, a Nikon oferece o BM (Medium Bright) objetiva, que é especialmente adequado para o exame visual dos flagelos de bactérias, protozoários, as fibras de fibrina, glóbulos minuto, e as células sanguíneas. Bright objectivos contraste fase de produzir imagens brilhantes em um fundo cinza médio.

Na maioria dos casos, limita-se avançar a fase relativa do surround wavefront sozinho não é suficiente para resultar na geração de imagens de alto contraste no microscópio. Isso ocorre porque a amplitude das ondas surround é significativamente maior que o das ondas difratadas e suprime as imagens resultantes criado por interferência de apenas uma pequena parcela do número total de vagas. A fim de reduzir a amplitude do surround wavefront para um valor próximo ao da onda difratada (e impor interferências no plano da imagem), a placa fase o objectivo é o aumento na opacidade pela aplicação de uma semi-transparente metálicos (neutro densidade) de revestimento. Surround ondas de luz, que passam quase que exclusivamente através da placa fase do projeto no microscópio de contraste de fase, são drasticamente diminuída em amplitude pela chapa fase opaca para um valor que varia entre 10 e 30 por cento da intensidade original.

As configurações da placa de fase, as relações de onda, e diagramas de vetores associados com a geração de imagens de contraste positivo e negativo fase são apresentados na Figura 6. Além disso, os exemplos de espécimes fotografada por estas técnicas também são ilustrados. Como discutido anteriormente, a frente de onda esférica de luz difratada emergentes do plano de amostra é retardado por um parente quartas-de-comprimento de onda para a fase de planar surround (ou undiffracted) wavefront. Em contraste de fase positiva configuração óptica (linha superior de imagens na Figura 6), o surround (S) wavefront é avançada na fase de quarto comprimento de onda quando atravessa a placa de fase para produzir uma mudança de fase líquida de 180 graus (uma meia onda ). O surround avançado wavefront agora é capaz de participar em interferência destrutiva com a difração (D) as ondas no plano da imagem intermediária.

 

 

 

 

 

 

 

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